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气相色谱仪基础知识(三、分析方法建立及验证)

文章来源: 广东中准检测有限公司人气:1394发表时间:2018-08-03

气相色谱仪基础知识
          (三)分析方法建立及验证

1、样品的来源和预处理方法

      GC(气相色谱仪)能直接分析的样品通常是气体或液体,固体样品在分析前应当溶解在适当的溶剂中,而且还要保证样品中不含GC不能分析的组分(如无机盐),可能会损坏色谱柱的组分。这样,我们在接到一个未知样品时,就必须了解的来源,从而估计样品可能含有的组分,以及样品的沸点范围。如果样品体系简单,试样组分可汽化则可直接分析。如果样品中有不能用GC直接分析的组分,或样品浓度太低,就必须进行必要的预处理,如采用吸附、解析、萃取、浓缩、稀释、提纯、衍生化等方法处理样品。

2、确定仪器配置

所谓仪器配置就是用于分析样品的方法采用什么进样装置、什么载气、什么色谱柱以及什么检测器。

一般应首先确定检测器类型。碳氢化合物常选择FID检测器,含电负性基团(F、Cl等)较多且碳氢含量较少的物质易选择ECD检测器;对检测灵敏度要求不高,或含有非碳氢化合物组分时,可选择TCD检测器;对于含硫、磷的样品可选择FPD检测器。

对于液体样品可选择隔膜垫进样方式,气体样品可采用六通阀或吸附热解析进样方法,一般色谱仅配置隔膜垫进样方式,所以气体样品可采用吸附-溶剂解析-隔膜垫进样的方式进行分析。

根据待测组分性质选择适合的色谱柱,一般遵循相似相容规律。分离非极性物质时选择非极性色谱柱,分离极性物质时选择极性色谱柱。色谱柱确定后,根据样本中待测组分的分配系数的差值情况,确定色谱柱工作温度,简单体系采用等温方式,分配系数相差较大的复杂体系采用程序升温方式进行分析。

常用的载气有氢气、氮气、氦气等。氢气、氦气的分子量较小常作为填充柱色谱的载气;氮气的分子量较大,常作为毛细管气相色谱的载气;气相色谱质谱用氦气作为载气。

3、确定初始操作条件

当样品准备好,且仪器配置确定之后,就可开始进行尝试性分离。这时要确定初始分离条件,主要包括进样量、进样口温度、检测器温度、色谱柱温度和载气流速。进样量要根据样品浓度、色谱柱容量和检测器灵敏度来确定。样品浓度不超过10mg/mL时填充柱的进样量通常为1-5uL,而对于毛细管柱,若分流比为50:1时,进样量一般不超过2uL。进样口温度主要由样品的沸点范围决定,还要考虑色谱柱的使用温度。原则上讲,进样口温度高一些有利,一般要接近样品中沸点最高的组分的沸点,但要低于易分解温度。

4、分离条件优化

分离条件优化目的就是要在最短的分析时间内达到符合要求的分离结果。在改变柱温和载气流速也达不到基线分离的目的时,就应更换更长的色谱柱,甚至更换不同固定相的色谱柱,因为在GC中,色谱柱是分离成败的关键。

5、定性分析

所谓定性鉴定就是确定色谱峰的归属。对于简单的样品,可通过标准物质对照来定性。就是在相同的色谱条件下,分别注射标准样品和实际样品,根据保留值即可确定色谱图上哪个峰是要分析的组分。定性时必须注意,在同一色谱柱上,不同化合物可能有相同的保留值,所以,对未知样品的定性仅仅用一个保留数据是不够的,双柱或多柱保留指数定性是GC中较为可靠的方法,因为不同的化合物在不同的色谱柱上具有相同保留值的几率要小得多。条件允许时可采用气相色谱质谱联机定性。

被测物组分定性分析方法包括:

利用保留时间定性;

利用加入纯物质增加峰高法定性;

利用相对保留值定性;

利用碳数/沸点规律定性;

利用保留指数定性;

利用双柱或多柱定性;

利用检测器定性;

与其它方法结合定性。

6、定量分析

    要确定用什么定量方法来测定待测组分的含量。常用的色谱定量方法不外乎峰面积(峰高)百分比法、归一化法、内标法、外标法和标准加入法(又叫叠加法)。峰面积(峰高)百分比法最简单,但最不准确。只有样品由同系物组成、或者只是为了粗略地定量时该法才是可选择的。

峰面积(峰高)百分比法是根据检测器对待测物的响应(峰高或峰面积)与待测物的量成正比的原理进行定量的。因此必须准确测定峰高h或峰面积A。定量依据:


注:Mi– I组分的量;fi– I组分的校正因子;Ai–I组分的峰面积

1.峰面积A的测量

对称峰:峰高h与半峰宽的积即

A=1.065×h×W1/2

不对称峰:峰高与平均峰宽的积即

A=1/2×h×(W1/2+ W085)

自动求和(自动积分仪或色谱工作站)

直接给出A,H,W1/2

2. 定量校正因子

定量分析的依据是被测组分的量与响应信号成正比,但相同含量的物质由于物理、化学性质的差别,即使在同一检测器上产生的信号也不同,直接用响应信号定量,必然导致较大误差。故引入校正因子,在计算组分的量时,必须将峰面积A进行“校正”。

1)绝对校正因子

式中wi为组分I的量,它可以是质量,也可以是摩尔或体积(对气体);Ai为峰面积,f为换算系数,称为定量校正因子。

定量校正因子定义为:单位峰面积的组分的量。检测器灵敏度Si与定量校正因子有以下关系式:

2)相对校正因子fi

由于绝对校正因子fi与检测器灵敏度有关,它即不易准确测得(因为物质量Wi不易准确测量),因此定量分析中常用相对校正因子表示fi,即用一个物质作标准,用相对校正因子将所有待测物的峰面积校正成相对于这个标准物质的峰面积,使各组分的峰面积与其质量的关系有一个统一的标准进行折算。

归一化法的前提是,试样中所有组分产生信号并能检出色谱峰。依据组分含量与峰面积成正比。此方法优点是简便、准确,定量结果与进样量、重复性无关;色谱条件略有变化对结果几乎无影响。缺点是所有组分必须在一定时间内都出峰,必须已知所有组分的校正因子,不适合微量组分的测定。

外标法标准曲线法以Ai对xi标准曲线。该法不需校正因子。但进样量和操作条件必须严格控制外标法适用日常分析和大批量同类样品分析。

内标法在配制的每个标准溶液中以及待测试样中加一固定量为ms的内标物,以Ai/As对xi作图,得内标法校正曲线(以抵消实验条件和进样量变化)。对内标物的要求是:样品中不含有内标物质;峰的位置在各待测组分之间或与之相近;稳定、易得纯品;与样品能互溶但无化学反应;内标物浓度恰当,使其峰面积与待测组分相差不太大。

7、方法的验证

  所谓的方法验证,就是要证明所开发方法的实用性和可靠性。实用性一般指所用仪器配置是否全部可作为商品购得,样品处理方法是否简单易操作,分析时间是否合理,分析成本是否可被同行接受等??煽啃栽虬ǘ康南咝苑段?、检测限、方法回收率、重复性、重现性和准确度等。

下面就简单讨论其中几个可靠性参数:

1.方法的线性范围

即检测器响应值与样品量(浓度)成正比的线性范围,它主要由检测器的特性所决定。原则上。这一线性范围应覆盖样品组分浓度整个变化范围。线性范围的确定通常是采用一系列(多于3个)不同浓度的样品进行分析,以峰面积(或峰高)对浓度进行线性回归。当相关系数大于0.99时,就可认为足线性的,小于0.99时,就超出了线性范围。一个好的GC定量方法,其线性范围(以FID检测器为例)可达10;,线性相关系数等于或大于0.9999。

2.方法的检测限

检测限(DL)是指方法可检测到的最小样品量(浓度)。一般的原则是按照3倍信噪比计算,即气样品组分的响应值等于基线噪声的3倍时,该样品的浓度就被作为最小检测限,与此对应的该组分的进样量就叫做最小检测量-此外。忆验证定量方法时,还将10倍信噪比所对应的样品浓度叫做最小定量限,当用于法规分析时,这一数据应等于或低于法规方法所要求的实际样品中待测组分的最低允许浓度。

检测限的测定可用一个接近检测限浓度的样品进行分析,据所得色谱峰的峰高来计算。设此时浓度为c、相应的峰高为h(信号强度单位)、基线噪声为N(与h的单位相同),则检测限可按下面公式计算:

c/h=DL/3N;即DL=3Nc/h

噪声的大小与仪器的性能,特别是检测器及其电子电路的稳定性直接相关,也与载气的纯度、色谱柱的性能及操作条件有关。噪声的测定是在正常操作条件下,仪器稳定时,将信号放大(降低衰减或放大纵坐标)来测量,一般是测定样品出峰前后1min的基线噪声。

作为分析方法,检测限无疑是越低越好。为此,应选择灵敏度高的检测器,使用高纯度的载气和辅助气,同时要定期维护仪器,保持进样口和检测器的清洁,保持色谱柱的性能。此外,仔细优化分离条件、适当加大进样量(如采用大体积进样技术)也是降低检测限的常用方法。

3.方法回收率

即方法测得的样品组分浓度与原来样品中实有浓度的比率。如果样品未经任何预处理,则回收率一般可不考虑。只有当某些样品组分被仪器系统不可逆吸附时,回收率才是需要考虑的问题。如果样品经过了预处理,如萃取工艺,那就必须考虑整个方法的回收率。一般要求回收串大于60%,越接近100%越好。

回收率可用下述简单方法测定:配置一定浓度的标准样品,将其两等分,其中一份按方法步骤进行预处理,然后用GC分析。另一份则不经颈处理而直接用GC分析。两份样品所得待测组分峰面积的比率乘以100即是该组分的回收率。有时实际样品很复杂,特别是样品基质对预处理的回收率影响较大时,就必须用空白样品基质(确信不含待测物)制备标准样品,比如测定废水中有机农药残留量时,就要采用不含农药的水作空白基质,在其中加入已知量的农药标准品,然后进行处理和分析。处理后测得的组分含量与处理前加入量的比率乘以100就得到了回收率。

很显然,回收率太低时会影响方法的检测限。当样品处理过程较复杂时,应分步测定回收率,最后针对回收率最低的步骤进行方法改进,以期提高整个方法的回收率。

4.方法重复性和重现性

重现性是指同一方法在不同时间、地点、不同型号仪器、不同操作人员使用寸所得结果的一致性。与此近似的另一个术语是重复性,常指同一个人在同一台仪器上重复进样所得结果的一致性。事实上,二者常?;煊?,多数人不做严格区分。但大多数欧洲学者会严格区分二者的不同。我们认为对现代仪器来说,分析重复性是容易实现的,而重现性则是更重要的,也是方法验证所必须考察的。重现性和重复性都用多次分析所得结果的相对标准偏差(RSD)来表示。

方法的重现性应包括多次连续进样分析的重复性、不同时间(天与天之间)分析的重复性、不同型号仪器之间的重现性和不同实验室之间的重现性。作为方法开发人员,首先应测定重复性,即在相同条件下连续进样5—10次,统汁待测组分的保留时间和峰面积(或峰高)的RSD,一般要求保留时间的RSD不大于1%,峰面积的RSD不大于5%。文献报道的最佳重复性数据为保留时间的RSD小于0.1%,峰面积的RSD小于1%。

如果样品要经过预处理,还应测定同一样品多次处理的重复性。即同一样品取3—5份做平行处理,看最后测定结果的重复性。这一RSD值应不大于5%。当然,有些工业分析要求不大于10%即可。至于天与天之间的重现性也不应大于10%、

当上述重复性满足要求后,说明该方法在你的实验室是可靠的。要将此方法作为标准方法推广使用,还必须测定不同仪器、不同实验室之间的重现性。当这些重现性(RSD)都能满足要求时。这一方法的可靠性就得到了较为满意的验证。

此文关键词:气象色谱,仪器,基础知识
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